Molekularno-biologiczne metody badań i ich wykorzystanie

Molekularne biologiczne metody badańodgrywają dużą rolę we współczesnej medycynie, kryminalistyce i biologii. Dzięki postępom w dziedzinie badań DNA i RNA człowiek jest w stanie zbadać genom organizmu, zidentyfikować czynnik chorobotwórczy, rozpoznać pożądany kwas nukleinowy w mieszaninie kwasów itp.

Molekularne biologiczne metody badań. Co to jest?

Już w latach siedemdziesiątych i osiemdziesiątych naukowcyodszyfrować ludzki genom. Wydarzenie to dało impuls rozwojowi inżynierii genetycznej i biologii molekularnej. Badanie właściwości DNA i RNA doprowadziło do tego, że obecnie możliwe jest stosowanie tych kwasów nukleinowych w celu zdiagnozowania choroby, do badania genów.

Przygotowanie DNA i RNA

Molekularne biologiczne metody diagnozywymagają obecności materiału wyjściowego: częściej są to kwasy nukleinowe. Istnieje kilka sposobów wyizolowania tych substancji z komórek żywych organizmów. Każda z nich ma swoje wady i zalety, co należy wziąć pod uwagę przy wyborze metody izolacji kwasów nukleinowych w czystej postaci.

1. Przygotowanie DNA według Marmur. Metoda polega na leczeniu mieszaniny substancji alkoholem, w wyniku czego wytrąca się czysty DNA. Wadą tej metody jest stosowanie agresywnych substancji: fenolu i chloroformu.

2. Izolacja DNA za pomocą Bum. Podstawową używaną tu substancją jest tiocyjanian guanidyny (GuSCN). Promuje odkładanie kwasu dezoksyrybonukleinowego na wyspecjalizowanych podłożach, z których następnie może być zbierany za pomocą specjalnego buforu. Jednak GuSCN jest inhibitorem PTC, a nawet jego niewielka część, uwięziona w wytrąconym DNA, może wpływać na przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy, która odgrywa ważną rolę w pracy z kwasami nukleinowymi.

3. Wytrącanie zanieczyszczeń. Metoda różni się od poprzedniej tym, że cząsteczki samego kwasu dezoksyrybonukleinowego nie wytrącają się, lecz są zanieczyszczeniami. Aby to zrobić, użyj wymienników jonowych. Wadą jest to, że nie wszystkie substancje mogą się wytrącić.

4. Masowe badania przesiewowe. Metodę tę stosuje się w przypadkach, gdy dokładne informacje na temat składu cząsteczki DNA nie są potrzebne, ale konieczne jest uzyskanie pewnych danych statystycznych. Wynika to z faktu, że struktura kwasu nukleinowego może zostać uszkodzona przez traktowanie detergentami, w szczególności alkaliami.

Klasyfikacja metod badawczych

Wszystkie metody biologii molekularnej badań są podzielone na trzy duże grupy:

1. Amplifikacja (przy użyciu różnych enzymów). Obejmuje to reakcję łańcuchową polimerazy PCR, która odgrywa dużą rolę w wielu metodach diagnostycznych.

2. Brak odwołania. Ta grupa metod jest bezpośrednio związana z działaniem mieszanin kwasów nukleinowych. Przykładami są 3 rodzaje blottingu, hybrydyzacja in situ itp.

3. Metody oparte na rozpoznaniu sygnału z cząsteczki sondy, która wiąże się z określoną sondą DNA lub RNA. Przykładem jest system hybrydyzacji w rozwiązaniu Hybrid Capture System (hc2).

Enzymy, które można stosować w metodach biologii molekularnej

Wiele metod diagnostyki molekularnej wymaga użycia szerokiej gamy enzymów. Poniżej najczęściej używane:

1. Restrictase - "tnie" cząsteczkę DNA na niezbędne części.

2. Polimeraza DNA - syntetyzuje dwuniciową cząsteczkę kwasu dezoksyrybonukleinowego.

3. Odwrotna transkryptaza (revertaza) - stosowana do syntezy DNA na matrycy RNA.

4. Ligaza DNA - odpowiedzialna za tworzenie wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami.

5. Egzonukleaza - usuwa nukleotydy z końcowych odcinków cząsteczki kwasu dezoksyrybonukleinowego.

PCR jest głównym sposobem amplifikacji DNA

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest aktywnajest stosowany w nowoczesnej biologii molekularnej. Jest to metoda, w której ogromną liczbę kopii można uzyskać z pojedynczej cząsteczki DNA (amplifikacji cząsteczek).

Główne funkcje PCR to:

- diagnostyka chorób;

klonowanie DNA i genów.

Przeprowadzić reakcję łańcuchową polimerazyWymaga się z następujących elementów: wstępne cząsteczki DNA, termostabilną polimerazę DNA (Taq lub Pfu) deoksyrybonukleotydów fosforany (źródła zasad azotowych), startery (podkład 2 1 cząsteczkę DNA), a system sam bufor, który może zawierać wszystkie reakcje.

PCR składa się z trzech etapów: denaturacji, hybrydyzacji starterów i wydłużania.

1. denaturacji. W temperaturze 94-95 stopni Celsjusza proshodit złamania wiązania wodorowe pomiędzy dwoma łańcuchami DNA, a w rezultacie uzyskać dwa jednoniciowe cząsteczki.

2. Wyżarzanie starterów. W temperaturze 50-60 stopni Celsjusza startery są przyłączone do końców jednoniciowych cząsteczek kwasu nukleinowego przez rodzaj komplementarności.

3. Wydłużenie. W temperaturze 72 ° otrzymuje się córką dwuniciowe cząsteczki kwasu dezoksyrybonukleinowego.

Sekwencjonowanie DNA

Molekularne biologiczne metody badańczęsto wymagają znajomości sekwencji nukleotydów w cząsteczce kwasu dezoksyrybonukleinowego. Sekwencjonowanie służy do określenia kodu genetycznego. Diagnostyka molekularna przyszłości będzie oparta na wiedzy uzyskanej podczas określania sekwencji osoby.

Wyróżnia się następujące rodzaje sekwencjonowania:

• sekwencjonowanie przez Maxama-Gilberta;
• sekwencjonowanie według Sanger;
• pirosekwencjonowanie;
• sekwencjonowanie nanoporowate.